微生物和細胞培養中的無菌操作基本技術

更新時間：2021-10-15

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無菌操作技術不僅在微生物學研究和應用上起著舉足輕重的作用，在許多生物技術中也被廣泛應用，例如轉基因技術、單克隆抗體技術等。

無菌室，微生物實驗室內專辟的一個小房間，室外設一個緩沖間，緩沖間的門和無菌室的門不要朝向同一方向，以免氣流帶進雜菌。無菌室和緩沖間都**密閉，無菌室內的地面、墻壁**平整，不易藏污納垢、便于清洗，室內裝備的換氣設備**有空氣過濾裝置。工作臺的臺面應該處于水平狀態，無菌室和緩沖間都裝有紫外線燈（距離工作臺面1米），工作人員進入無菌室應穿戴滅過菌的服裝、帽子。

超凈臺，主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺面上部包括微生物在內的各種微小塵埃，通過電動裝置使空氣通過高效過濾器具后進入工作臺面，使臺面始終保持在流動無菌空氣控制之下。在條件較困難的地方，也可以用木制無菌箱代替超凈臺（正面開有兩個洞，不操作時用推拉式小門擋住，操作時可以將雙臂伸進去；正面上部裝有玻璃，便于在內部操作，箱內部裝有紫外線燈，從側面小門可以放進去器具和菌種、細胞株等）。

微生物的培養

在微生物的培養過程中，要保持培養物純凈性；培養微生物的要**，是為所需要的微生物提供良好的生存環境，同時阻止或抑制其他微生物的生長。

（一）培養基

1.認識培養基的基本組成成分，從生物體構成的基本元素這一角度理解培養基中為什么都需要具備這些基本成分。

2.培養基的用途和種類：液體和固體兩大類。

3.不同的微生物往往需要采用不同的培養基配方；盡管培養基的配方各不相同，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和無機鹽。

4.培養基是否合格（無菌試驗）：培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長（液體不變渾濁），說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。

（二）無菌技術

1. 無菌技術的概念
無菌操作泛指在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。日常的生活環境中，每時每刻每處都存在著微生物，任何一個不經意的動作都可能將某種微生物引入到培養物中。在具備無菌環境和獲得無菌材料后，還要始終保持無菌狀態，才能對某種特定的已知微生物進行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現象，在微生物學叫做污染雜菌。防止污染是微生物學工作中十分**的技術：*滅菌和防止污染是無菌技術的兩個方面。此外，要有效避免操作者自身被微生物感染，還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經過基因工程改造了的本來自然界不存在的微生物從我們的實驗容器中逃逸到外界環境中去（生物安全）。無菌操作非常重要，無論是倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，只有熟練、規范地進行無菌操作，才可能成功地培養微生物。

2. 消毒與滅菌的概念

（1）培養細菌用的培養基與培養皿（需要滅菌）

（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（需要滅菌）

（3）實驗操作者的雙手（需要消毒）

（4）接種環、針、涂布棒：灼燒滅菌（外焰）。

3.倒平板

（1）滅菌后，培養基冷卻到55 ℃后應及時進行倒平板操作，如果不能及時操作，需要將培養基放到55℃左右的電熱箱中保溫，以防止瓊脂凝固（用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了）；每個72mm培養皿需要培養基12~15ml。

（2）為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。

（3）平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。

（4）在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此**好不要用這個平板培養微生物。

4. 平板劃線

（1）為什么在操作的**步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？

答：操作的**步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到單個菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的細菌，避免細菌污染環境和感染操作者。

（2）在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

答：以免接種環溫度太高，殺死細菌。

（3）在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，**終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

5. 涂布平板
應從操作的各個細節保證“無菌”，涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍，等等。

細胞培養

體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定細胞培養成敗的**。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，操作技術不規范，也會導致污染。因而，所有操作都要**大可能的保證無菌，每一項工作都**做到有條不紊和*可靠。（心中有數）

（一）培養前準備
在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養室、超凈臺)內，然后開始消毒。這樣可以避免開始實驗后，因器材不全往返拿取而增加污染機會。

（二）操作區消毒
無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用70酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。實驗用品，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺，同時紫外線消毒。

（三）洗手和著裝
原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養操作時，可穿裝細胞培養室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用70%酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養室需*洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

（四）火焰消毒
在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，**先要點燃酒精燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處進行。但要注意：燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷；吸取過營養液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養液中；開啟、關閉長有細胞的培養瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細胞；另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞。

（五）操作
開啟無菌操作臺風機運轉10分鐘后，才可開始實驗操作，動作要準確敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空氣流動，增加污染機會。無菌操作工作區域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出,以利氣體流通。實驗操作應在操作臺中央無菌區域內進行，勿在邊緣非無菌區域操作。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央。工作自始**終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口（敞開直立可增加落菌污染機會）。吸取營養液、PBS、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或導致細胞交叉污染。工作中不能面向操作區講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發生污染。手或相對較臟的物品不能經過開放的瓶口上方，不要在打開的容器正上方操作實驗容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。瓶口**易污染，加液時如吸管、吸頭尖碰到瓶口、瓶外，則應將吸管換掉。每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。驗結束后，將實驗物品帶出工作臺，如需要繼續進行下一個實驗，則用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風機運轉10分鐘后，才可進行下一個實驗操作。

（六）安全
工作人員應注意自身的安全，**穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心,并選擇適當等級的無菌操作臺(**少兩級)。操作過程中，應避免氣溶膠的產生，小心有毒性試劑，例如DMSO（二甲基亞砜），并避免尖銳物品傷人等。

（七）定期檢測下列項目

1. CO2 鋼瓶的CO2 壓力

2. CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)； CO2 培養箱定期消毒。

3. 無菌操作臺內氣流壓力是否正常，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300 小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。